南海一中生物科组王平 （广东省佛山市南海区第一中学 528252）
Teaching Design of “Isolation of Cellulose Degrading Microorganisms”
Wang P
摘要 围绕造纸废水处理问题，以从土壤中分离分解纤维素的微生物为目的，引导学生对生物学现象进行合理思考和解释，能设计实验方案、熟练掌握操作技能，学会团队合作，体悟科学研究的过程、方法与思维方式，能科学精准地进行语言交流，从而提高科学思维与探究的能力。
关键词 纤维素分解菌 科学思维 科学探究
中国图书分类号：G633.91 文献标识码：B
1 教材分析
“分解纤维素的微生物的分离”是人教版选修1专题2课题3的内容，是在学习了微生物培养的基础知识和基本的操作技能、对特定的微生物的分离计数和鉴定、选择性培养基的配制和作用的基础上，增加了鉴别性培养基的知识及其应用。因此本节内容是对本专题的相关基础知识和操作技能的进一步强化，在本专题中起巩固和提高的作用。本节课内容主要有两大部分：一部分是纤维素与纤维素酶，另一部分是纤维素分解菌的分离，计划分2课时完成。全国I卷选修一部分14年卷考查了刚果红染色的基本原理和纤维素酶、培养基的基础知识，17、18年主要考查了选择培养的原理，可见本节内容涉及的基本知识和能力在高考中具有重要地位。
2 教学目标
1）生命观念：理解纤维素分解菌作为生态系统结构中的分解者，对生态系统物质循环、稳定性的维持具有重要作用，建立结构功能观。理解在多年落叶形成的腐殖土中易于筛选出能分解纤维素的微生物，建立进化适应观。
2）科学思维：能通过比较、分析与综合等方法对生物学现象进行解释、推理，做出合理的判断。
3）科学探究：能理解实验目的、原理，掌握相关的操作技能；能做出假设和预期、确认变量、设计可行的实验方案、对结果进行合理解释；具备团队合作与交流的能力。
4）社会责任：关注生物学原理和技术在生产实践中的应用。
3 教学重难点
从土壤中分离分解纤维素的微生物
4 教师预实验
教师依据选修1P.28实验流程（图2-14）开展预实验。因为真菌是自然界中纤维素的主要降解者[1]，因此选择培养基采用了筛选霉菌的查氏培养基，并在此基础上添加了纤维素粉和减少蔗糖的用量，配方如下：蔗糖 0.1g，NaNO3 0.2g，Na2HPO4？7H2O 0.2g，MgSO4？7H2O 0.1g，KCl 0.1g，FeSO4？7H2O 0.002g，纤维素粉2g，蒸馏水200mL。鉴别培养基配方如下：CMC-Na 1.5g，蛋白胨0.2g，酵母粉0.1g，NaCl 0.25g，KH2PO4 0.2g，MgSO4？7H2O 0.1g，琼脂粉4g，蒸馏水200mL。选择培养基和鉴别培养基的配方均参考了选修1教师用书光盘中本节实验采用的配方。称量20g土壤加入到200ml选择培养基，30℃ 200rpm振荡培养两天后，进行梯度稀释，每个梯度的稀释液均涂布3个平板，30℃培养两天发现所有的平板均密布菌落，刚果红染色后也看不到明显透明圈。进行第2次预实验，省略选择培养其它与第1次相同，结果发现104-106倍稀释液涂布染色后均可见明显的透明圈，如图1、图2。
图1 第二次预实验结果（1） 图2 第二次预实验结果（2）
5 教学策略
采用“探究式教学方法”，以学生为中心，教师为主导，注意从生产实践实例导入，通过提出问题、分析现象、设计方案、指导操作，在探究的过程中培养生物学核心素养。将全班同学分为6个组，各组选出1位组长，负责指导和督促组员规范操作。学生学法有交流法、观察法和实践法。
6 教学过程
6.1 情境引入 造纸厂排出的工业废水中含有大量纤维素等其它杂质，若不经处理任意排放，会对水体造成极大的危害。如何通过生物方法分解废水中的纤维素？学生会回答：通过纤维素酶的降解。引导学生阅读P.27纤维素与纤维素酶。土壤中存在能产生纤维素酶的微生物，从中筛选出高效纤维素降解菌，对造纸废水的生物处理及纤维素资源的再利用具有非常重要的意义[2]。为了成功分离出土壤中的纤维素分解菌，取样的环境应具备哪些特点？布置学生预习课本，放学后集中校门外香蕉林采集土样。
6.2 采集土样 学生在取样地交流应采集多年落叶形成的腐殖土，易于分离出目的菌，这是根据生物与环境相适应的原理推理出来的，采样点的环境见图3。当天晚上指导组长进行称量土壤、梯度稀释的操作。
6.3 第1天实验 倒平板、梯度稀释和平板涂布
6.3.1 讨论选择培养
提问1：如果土样中的相关微生物较少，如何采取措施增加菌体浓度，以确保能够从样品中分离到所需微生物？选择培养基的特点是什么？
图3 采集土样点的环境 图4 第一次预实验结果
资料1：展示教师第1次预实验结果，如图4为选择培养2天后的菌液，105倍稀释液取样涂布，培养2天后平板上的菌落，染色后看不到明显的透明圈。
提问2：预实验出现了图示结果，说明了什么？正式实验该如何改进实验方案？
小组交流讨论，得出本组意见。全班讨论后明确：1）可通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度。选择培养基是液体培养基，以纤维素粉为唯一碳源。2）老师的预实验结果菌落数过多，说明土样中的纤维素分解菌含量丰富，正式实验可以省略选择培养这一步。
6.3.2 倒平板 每组成员在组长的指导下各倒1个平板备用。
6.3.3 梯度稀释 教师请某小组的组员说出梯度稀释的过程、注意事项，再请该组组长在全班同学前演示梯度稀释过程。结束后再请其他组组员评价该组长的操作是否规范。
6.3.4 平板涂布 提问1：根据预实验经验，选取104-106倍稀释液进行涂布，每个梯度至少涂布几个平板？如何设置对照？
提问2：鉴别培养基的特点是什么？纤维素分解菌的鉴别原理是什么？
学生涂布完后，小组阅读课本交流讨论，得出本组意见。全班讨论后明确：1）每个梯度至少需要涂布3个平板，对照组涂布等量无菌水代替。2）鉴别培养基是固体培养基，以纤维素为主要碳源，对纤维素分解菌具有选择作用，也属于选择培养基。刚果红与纤维素形成红色复合物，但不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。课本给出的鉴别培养基中还含有淀粉类物质，能产生淀粉酶的微生物可能会出现假阳性反应。
6.3.5 组长评价组员：组长从预习认真程度、实验操作规范程度等方面评价组员的表现。第1课时结束，将全班涂布的平板和空白对照平板放入30℃培养箱培养2天。
6.4 第3天实验：刚果红染色、观察、灭菌
提问1：在实验中如何判断制作的培养基是否合格？鉴别培养基上长出的菌落形状、大小、隆起程度和颜色是否一致？
提问2：课本给出了两种刚果红染色法，两种方法各有哪些优缺点？
提问3：若要筛选出分解纤维素能力最强的菌落作为处理造纸废水的菌种，采用什么方法比较不同菌落分解纤维素的能力？
提问4：如何定量测定不同菌落产生的纤维素酶的酶活力？如何对筛选出的菌种进行冻存？
刚果红染色、NaCl洗脱结合不牢固的刚果红的操作均较简单，在染色和脱色等待的过程中可以让学生包扎下一个班使用的平板、滴管，5支装9ml蒸馏水的试管塞上棉塞并包扎，全部放进灭菌锅灭菌，熟悉高压灭菌锅的操作方法。
学生染色脱色完后，对上述问题分小组讨论并形成本组意见。全班交流得出：1）对照组的培养基在培养过程中没有菌落生长说明培养基制作合格。由于本实验是从土壤中筛选分解纤维素的一类菌种，不是单一菌种，因此菌落的形状、大小、隆起程度和颜色可能会不一致。2）方法一缺点是操作烦琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二优点是操作简便，不存在菌落混杂问题；缺点是有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红，形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分[3]。3）可以通过比较各组分离出的纤维素分解菌透明圈直径与菌落直径比值，比值越大，能力越强。
教师介绍问题4的操作：①纤维素酶活力测定方法：用滤纸等纤维素作底物，在50℃恒温水浴下，经纤维素酶水解0.5h后生成葡萄糖，然后用DNS（3,5-二硝基水杨酸）法测定葡萄糖含量，根据葡萄糖的量比较酶活力大小[4]。②用灭菌牙签挑出产纤维素酶能力强的菌落到液体培养基，30℃振荡培养1-2天后，将灭菌甘油与菌液等比例混合于1.5ml塑料离心管中（如图6），-20℃保存。教师可指导组长将筛选到有透明圈的菌落用灭菌牙签转移到新的培养基培养（如图5），若条件具备还可以开展冻存、测酶活力、显微镜下观察菌株菌丝及孢子形态对其进行初步鉴定的拓展实验[5]。
师生共同总结：这两节课围绕造纸废水处理问题，以从土壤中分离分解纤维素的微生物为目的，进行实验设计，筛选出能分解纤维素的菌落并对其产酶能力进行了初步比较。通过实验操作和交流掌握了土壤取样的注意事项、选择培养的目的、染色的注意事项以及分离培养微生物的一般方法。
图5 纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈 图6 冻存的操作
7 反思
整个教学设计以培养科学思维和科学探究能力为目的，引导学生善于运用生物学知识对生物学现象进行思考和解释，体悟科学研究的过程、方法与思维方式，能科学精准地进行语言交流。分小组进行实验教学，提前培训小组长做小老师，不仅使他们对学到的知识印象深刻，而且提高了解决问题的能力和责任心，由此产生较高的成就感和自信。组长对组员的指导和监督、组员组长间的互评、合作和交流等措施，对于班级整体实验探究能力的提升具有极好的促进作用。
主要参考文献
[1] 贾丙志,范运梁,程文静.纤维素降解菌筛选的研究进展[J].现代农业科技,2008,(21):315
[2] 魏桃员,张素琴,邵林广,游映玖.一株纤维素降解细菌的分离及特性研究[J].环境科学与技术,2004,27（5）:1
[3] 人民教育出版社,课程教材研究所生物课程教材研究开发中心.普通高中课程标准实验教科书教师用书:生物﹒选修1﹒生物技术实践[M] .北京:人民教育出版社,2007:21
[4] 张丽影,汪寒寒,潘婷,等.产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件优化[J].纤维素科学与技术,2015,23(2):1-7.
公安备案44060502000156